结直肠癌 RAS 检测指南

结直肠癌是英国发生率最高的癌症之一，每年新诊断 4 万例，5 年生存率 55%，只有 23% 转移病人有治疗前分期数据，15% 的病人虽然接受了手术治疗，但是仍然会出现复发转移。

结直肠癌治疗的一个重要发展步骤是单克隆抗体的出现，它能靶向抑制 EGFR。单克隆抗体治疗包括西妥昔单抗、贝伐单抗和帕尼单抗。现有数据明确表明 KRAS 突变结直肠癌抗 EGFR 治疗无效。

早期数据限于 KRAS 密码子 12 和 13，能够预测西妥昔单抗治疗是否无效，NICE 推荐该研究结果用于实际工作中。西妥昔单抗只能用于肝转移性结直肠癌，在确定病人是否适合该治疗时应进行 KRAS 密码子 12 和 13 突变检测。

本指南里没有推荐一线化疗后进展的转移性结直肠癌病人使用 EGFR 抑制剂，虽然已有结果支持这样使用。KRAS 检测已成为常规项目，帮助分层病人是否适合抗 EGFR 治疗。英国之外的其它组织也推荐结直肠癌治疗时要进行 KRAS 基因的检测。

Wong 医生在 JCP 杂志上发文，文章主要用于指导英国的临床实践工作，文中还涉及结直肠癌 NRAS 的检测，对影响结直肠癌 RAS 检测的技术和研究内容也进行了回顾，文中特别强调的是检测的实用意义。文章内容顺序按照 RAS 标本检测程序进行。

病例选择

常规检测还是按需检测

结直肠癌症 RAS 检测是常规检测还是按需检测仍有争议。常规检测模式指所有手术切除标本都常规行基因检测，在病理报告上描述结果。未来某个时候如果病人需要抗 EGFR 治疗，这些分子数据立刻可以使用。

常规检查可以很好解决过长的 KRAS 基因检测时间。检测时间过长并不是分析方法造成的，大部分时间用于筛选合适的组织。常规检测还会避免出现因组织块丢失、组织块保存不当受损或者因用于其它检查而不能进行 RAS 检查。

常规检查缺点是对那些永远不发展为转移的病人，做这种检查是不必要的。减少不必要检查的方法就是找出具有高危转移因素的结直肠癌标本进行检测，例如存在血管侵犯、淋巴结转移或者是病理 T4 分期。

常规检查最大缺点是，新数据表明 RAS 不只是 KRAS 密码子 12 和 13 突变。如果病人拟接受抗 EGFR 治疗，之前曾经接受过 KRAS 密码子 12 和 13 检查，那么现在这个病人还要接受 NRAS 突变和附加 KRAS 突变检测。

近期研究表明，更多基因与抗 EGFR 治疗耐药有关，新靶向治疗不断出现。按需检查是病例经过多学科组讨论后决定接受相关治疗时才会进行的检查。撰写本文时，英国的实验室给结直肠癌转移病人做 RAS 检测保险才给予赔付，这意味着在英国按需检测已经成为主流实践方式。

为了在英国能够更好地实现 RAS 检测，应该对现有资源进行合理分布，建立更合理的检测系统，改善结直肠癌组织送检途径，确保及时送达标本进行按需检测。

原发还是转移组织

很多研究都在探讨 KRAS 突变在原发或是转移的结直肠癌组织中是否一致。一项 meta 分析显示一致性非常高，达 94.1%。然而也有一些数据表明这种一致性与解剖位置有关，肺和淋巴结转移灶与原发灶一致性较差。上述的 meta 分析中也表明淋巴结转移和原发结直肠癌的一致性是 81.3%。

由于原发灶与转移灶缺少绝对的遗传学一致性，如果可以获取转移结直肠癌组织，并能将组织尽快送达检测实验室，那么对转移组织进行检测是优先的。如果转移组织很不容易获取，就送检原发位置的组织，因为截至目前为止没有充足证据说明转移灶组织 RAS 基因检测更具特异性。

标本类型

组织病理学或细胞学标本都可以用作 RAS 检测，包括使用 HE 染色或是免疫组化染色的切片标本。一些标本例如内镜或粗针活检标本，由于标本获取技术导致标本有限，如果是切除标本就可以有多个肿瘤组织标本可用，但通常只选择一个具有代表性的组织标本进行检查。有限的标本引发了一些需要思考的内容。

只含有腺瘤的活检标本

第一种是如果病人临床和影像学证据清楚显示患有结直肠癌，但内镜活检标本却只有腺瘤，而且该标本是唯一可用于 RAS 检测标本。这时应怎么做？有人认为不应检测腺瘤标本，应对原发或转移灶重新活检；另一些人认为应检测腺瘤，一旦鉴定突变应报告，若没有突变，也不能证明肿瘤没有突变，仍需重新活检。

第二种方法是基于 RAS 基因突变通常发生在肿瘤形成早期阶段，且是关键驱动突变，证明腺瘤中存在 RAS 突变，表明从腺瘤发展来的结直肠癌也可能有该突变。然而 RAS 突变也可能是结直肠癌发生晚期事件，也就是说腺瘤可能是 RAS 野生型，而腺癌则可能是 RAS 突变型。

第三种方法与第二种相似，对具有高级别异型增生的腺瘤进行检测，高级别异型增生是更接近癌症的一种状态。

肿瘤内突变的异质性

另一个问题是若有多个切除标本供选择，究竟选哪一个？这个主题涉及肿瘤突变异质性，即同一结直肠癌中不同克隆的基因表型可能不一致。内镜标本通常是有限和表浅标本，若突变克隆位于肿瘤深部，可能检测不到；如果是切除标本，突变克隆只存在于某个特定组织块内，也可能检测不到。

根据最新 KRAS 和 NRAS 数据，通常认为只要存在任何一种 RAS 突变，就足以预测抗 EGFR 治疗耐药。如果超过一种以上 RAS 突变共存于同一结直肠癌内，也不会有更多的临床意义。

更具临床意义的是同一肿瘤内既有 RAS 突变型克隆又有野生型克隆，特别是突变克隆比例很低的时候。后者指的是一种低水平突变，原因可能是结直肠癌 DNA 抽提物中只有一小部分 RAS 突变基因，这需要与组织块中恶性肿瘤细胞含量低导致非恶性肿瘤细胞 DNA 稀释突变基因这种情况鉴别。

一些数据显示，同一结直肠癌组织内还存在 KRAS 基因型变化。小部分结直肠癌是野生型和 KRAS 外显子 2 和 3 突变克隆的混合，这种基因型的变化很小：10/13 标本中，某一特定 KRAS 突变克隆超过肿瘤 80%。

最近一项研究使用高分辨率溶解曲线分析检查 30 例配对内镜标本和切除标本的 KRAS 突变，结果发现每对标本基因型完全一致。

更敏感方法回顾分析野生型结直肠癌是否有更低水平 KRAS 突变，此水平突变对抗 EGFR 治疗是否有影响。Sanger 测序或 real time-PCR 鉴定的野生型结直肠癌，7%-20% 病例经焦磷酸测序、Therascreen 检查包、锁定核酸 PCR 或突变扩增 PCR 再次检查，发现 KRAS 密码子 12 和 13 突变，此种水平 KRAS 突变结直肠癌抗 EGFR 治疗是否有效仍需研究。

更敏感检查方法出现后，肿瘤内突变异质性研究可能会有特别进展，目前临床工作可按指南规定进行。如果既有切除标本又有活检标本可用，检测时应优选组织块；如果只有活检组织可用，结果是野生型基因型，现在没有充足证据支持再次活检排除低水平突变。

突变检查不仅仅影响治疗选择，更重要的是低水平突变的存在可能是预测未来抗 EGFR 治疗耐药的标志。通常认为这些突变克隆开始时量少，但抗 EGFR 治疗促使突变克隆过度生长，当量足够充足时表现为对治疗耐药。

准备工作中的影响因素

已有综述文章详细描述组织标本制备过程中哪些因素会影响后续的分子检测结果，以下内容与结直肠癌的 RAS 检测关系特别密切。

大部分用作 RAS 突变检测的结直肠癌组织来自福尔马林固定的活检标本或是手术切除的原发肿瘤。后者标本固定通常会延迟或固定效果不好，主要由于大肠没有被完全剖开或是没有冲洗干净，或是只取材了部分固定的标本。

延迟或固定效果不好，导致 DNA 因为凋亡或是坏死而降解，福尔马林浸泡过长也使 DNA 由于过度交联而降解。DNA 质量不合格，降低了检测突变敏感性，增加失败几率。福尔马林固定还可以致胞嘧啶脱氨基，导致检测到人为因素所致的突变。

在英国 Bouin 固定液通常不再使用，较早期的组织块可能由 Bouin 固定。需要小心的信号是组织块内组织完全变成黄色或是组织中含有 DNA 抽提过程中的洗脱液。以 Bouin 固定的组织行分子检测时失败几率较高，部分由于组织保存时间过长，还有就是 Bouin 固定液中一些成分能加速核酸降解。

一些医院固定内镜活检标本前习惯先将标本锚定在醋酸带上，如果不去除醋酸带会导致 DNA 产量更低。记录肿瘤细胞含量对分子学分析来说是恰当的。组织被做成切片或是直接切取用于 DNA 抽提，没有技术差别，切取后组织应尽快 DNA 提取以减少 DNA 氧化。

恶性肿瘤细胞含量

当体突变组织中既包含有恶性细胞又含有非恶性细胞时，精确定量恶性肿瘤细胞含量很关键。在最后的 DNA 提取物中恶性肿瘤细胞 DNA 所占的比例能很好地反应组织病理学恶性核酸占所有核酸的比例，优于用肿瘤所占面积的比例进行衡量。

这一点对结直肠癌特别重要，坏死和无细胞区域不应该被计算在内，应当将其尽可能去除。肿瘤中非整倍染色体很常见，可能潜在增加或减少检测敏感性。本文推荐，用于检测突变的最少肿瘤细胞含量应是检测最低肿瘤细胞含量的二倍。

例如某种方法检测要求肿瘤细胞最低含量 5%，突变检查时最少需要组织中含有 10% 的恶性细胞比较合适。观察者评估结直肠癌中肿瘤细胞含量时会有变化，所以实验室希望使用一个安全的最小肿瘤细胞含量进行分析，但这个比例仍需进一步验证。

分析方面

分析方法选择

在英国很多分析方法用于 KRAS 检测，NHS 实验室广泛使用的分析包括 house 焦磷酸分析法、COBAS、Therascreen 焦磷酸法或 RGQ 包、Sanger 测序和 HRM 分析，已有研究比较不同分析方法的特点。各种分析方法已做详细阐述，NICE 诊断评估程序中也进行了分析，相关文章即将发表（表 1）

表 1. 较常应用的 RAS 检查方法特征比较

分析方法的选择也许会受最新研究结果影响，即任何 RAS 突变足以预测抗 EGFR 治疗耐药。所以未来检测方法的重点要放在 RAS 检测上，而不仅仅只是 KRAS。

分析方法的确认

RAS 分析方法中的几个方面在真正用于临床前应进一步确证。首先要明确，检查突变时所需最少肿瘤细胞含量。另外分析的准确性和精确性也需要进行评估和记录。第三，确证所需要的临床标本数量依赖于统计功效。目前推荐序列分析法用作金标准方法。

检测失败

大多数结直肠癌 RAS 检测失败都是由分析前因素所致，如 DNA 模板数量不足或质量较差。影响模板数量原因包括标本大小、大体切除程度、恶性组织比例。如果蜡块中恶性组织不充足，就需要进一步获取。矛盾的是如果有太多的模板也可能导致失败，这时只需稀释就可以获得成功。

影响模板质量因素包括固定相关的降解，是检查失败的主要原因，尤其是当扩增片段较大时。当检测失败时应当对分析技术进行评估，如果有可能应对标本采用其它方法进行分析。

报告与解释

指导靶向治疗的最小 KRAS 含量已有明确推荐（表 2）。最近的争论是否 KRAS 密码子 13 突变对抗 EGFR 治疗耐药影响较小。

表 2. 用于指导 EGFR 治疗的最小 RAS 含量

新数据表明 KRAS 密码子 12 和 13 野生型时，KRAS 密码子 59、61、117 和 146 或 NRAS 密码子 12、13、59 和 61 仍可预测抗 EGFR 治疗耐药。NRAS 密码子 117 和 146 突变无影响。本文推荐 RAS 检测至少应包括 KRAS 密码子 12、13、59、61、117、146 和 NRAS 密码子 12、13、59、61。

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BRAF都要檢測的,

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